생합성 과정의 일시적인 분리는 출아 효모 세포 주기 동안 대사 진동을 담당합니다.
Oct 18, 2023Nature Metabolism 5권, 294~313페이지(2023)이 기사 인용
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진핵 세포 분열의 기본 과정을 제어하는 많은 세포 생물학적 및 생화학적 메커니즘이 확인되었습니다. 그러나 세포 분열 주기 동안 생합성 과정의 시간적 역학은 여전히 파악하기 어렵습니다. 여기서 우리는 주요 생합성 과정이 세포주기를 따라 일시적으로 분리되어 있음을 보여줍니다. 신진 효모를 모델로 사용하고 단일 세포 방법을 사용하여 대사 활동을 동적으로 측정하면 G1 및 S/G2/M 단계에서 단백질 합성의 두 피크를 관찰하는 반면 지질 및 다당류 합성 피크는 S/G2 동안 단 한 번만 나타납니다. /M 단계. 추론된 생합성 속도를 열역학적-화학량론적 대사 모델에 통합하면, 생합성 과정에서 이러한 시간적 분리가 G1에서 포도당 흡수 플럭스의 가속과 산소 및 이산화탄소 교환의 위상 이동 진동과 함께 1차 대사의 플럭스 변화를 일으킨다는 것을 발견했습니다. . 모델 예측의 실험적 검증을 통해 우리는 일차 대사가 세포 주기 동안 예상치 못한 역학을 나타내는 생합성 과정의 변화하는 요구를 충족시키기 위해 세포 주기 주기로 진동한다는 것을 입증합니다.
세포 성장과 분열은 기본적인 생물학적 과정입니다. 우리는 세포 분열 주기를 제어하는 세포 생물학적 및 생화학적 메커니즘에 대해 확고하게 설명하고 있지만, 세포 주기 동안 세포 성장을 촉진하는 생합성 및 일차 대사의 시간적 역학에 대해서는 훨씬 덜 알고 있습니다. DNA 생합성은 S 단계 내에서 일시적으로 제한되는 것으로 알려져 있지만, 단백질 및 지질 합성과 같은 다른 주요 생합성 과정의 역학은 아직 불분명합니다. 생합성 과정은 전체 세포주기에 걸쳐 지속적으로 활성화됩니까? 이들의 활동이 변하면 다양한 생합성 과정의 속도도 같은 방식으로 변합니까? 이러한 지식은 질병과 관련된 결함이 있는 세포 성장 조절의 메커니즘을 밝히는 데 필수적입니다1,2.
현재, 단백질 합성은 방사성 표지3,4,5 및 단일 세포 분석6,7을 사용한 인구 수준 연구에 의해 결정된 바와 같이 효모 세포 주기 전반에 걸쳐 기하급수적으로 또는 일정한 속도로 증가하는 것으로 간주됩니다. 그러나 최근 우리는 내인성 TEF1 프로모터에 의해 제어되는 녹색 형광 단백질(GFP)의 생산 속도가 G1에서 최고조에 달한다는 사실을 발견했으며(참조 8), 이는 단백질 생합성 활성이 실제로 세포 주기 동안 비단조적일 수 있음을 시사합니다. 이 발견은 G1에서 관찰된 리보솜 단백질 풍부도의 피크와 일치하지만(참조 9), 다른 사람들은 그러한 역학을 발견하지 못했습니다. 마찬가지로, 리보솜 생합성 및 번역과 관련된 유전자의 발현도 G1에서 최고조에 달하는 것으로 관찰되었습니다(참조 10,11). 그러나 단일 세포 RNA 서열 분석(RNA-seq) 연구에서는 G1에서 리보솜 단백질 mRNA가 약간 증가한 것으로 보고되었거나(참조 12) 세포 주기에 걸쳐 눈에 띄는 차이가 없다고 보고되었습니다13. 지질 및 핵산과 같은 다른 거대분자 클래스의 경우, 최근 다중 오믹 연구9,10에 따르면 이들의 생합성은 세포 주기의 특정 단계에서 가속화되는 것으로 제안되었습니다. 그러나 이들 연구에서 측정된 분자 풍부도는 실제 생합성 속도에 대한 간접적인 증거만을 제공합니다. 따라서 세포주기 동안 생합성 활동의 시간적 역학은 여전히 대체로 파악하기 어렵습니다. 이 질문에 대답하려면 역동적이고 세포 주기를 해결하는 방식으로 속도를 측정해야 할 것입니다. 이는 지금까지 엄청난 기술적 과제를 안고 있습니다.
여기에서 신진 효모를 모델로 사용하고 새로운 정지 및 응답 방법을 갖춘 동적 단일 세포 형광 현미경을 사용하여 단백질, 지질 및 다당류 생합성 활동이 세포 주기 동안 기하급수적이거나 일정하지 않다는 것을 발견했습니다. 구체적으로, 우리는 단백질 생합성이 세포 주기당 두 가지 활성 파동을 나타내는 반면, 지질 및 다당류 생합성의 활성은 G1의 단백질 생합성의 첫 번째 파동 동안 낮지만 S/G2/M의 두 번째 파동 동안에는 높다는 것을 발견했습니다. 우리는 발견된 생합성 활동 패턴을 세포 질량 역학의 수학적 모델을 통해 절대 단위로 변환하고 이를 열역학적-화학양론적 대사 모델에 통합하여 1차 대사 플럭스의 세포 주기 역학을 추론했습니다. 우리는 추론된 대사 플럭스 변화를 실험적으로 검증할 수 있었기 때문에 이는 발견된 생합성 활동의 동적 패턴에 대한 추가 증거를 제공했으며 또한 생합성 과정의 시간적 분리가 일차 대사의 시간 단위 진동에 책임이 있다는 결론을 내릴 수 있게 했습니다. . 우리의 연구는 세포 주기 동안의 세포 성장이 일시적으로 분리된 생합성 및 일차 대사 과정의 집합이며, 이는 세포 생리학의 기본에 대한 근본적인 통찰력을 제공한다는 것을 보여줍니다.
threefold change) and respective cell growth rates (>11-fold change), which are larger spreads than those during the cell cycle (~1.4-fold change of dry mass and ~1.6-fold change of dry mass derivative, as estimated from our data). The changes in protein synthesis rate during the cell cycle that we report here could thus be well hidden in the noise of the cell mass/growth rate data from the other work57. Moreover, cellular composition changes during the cell cycle could potentially confound a direct comparison of the buoyant-mass data57 with our dry-mass-related data (as shown in formula 1 in recent work58). The authors of the paper57 have cautiously not made any conclusion on cell-cycle dynamics of cell growth rate in yeast./p> \Delta \bar t_{\mathrm{START}} \cap E^c = {\mathrm{ME}}\), \(\varphi ^c > \Delta \bar t_{\mathrm{BUD}} \cap E^c = {\mathrm{START}}\) or \(\varphi ^c > \Delta \bar t_{CC} \cap E^c = {\mathrm{BUD}}\). Therefore, we arrived to a smaller or the same set of cells \(S2,\left| {S2} \right| \le \left| {S1} \right|,\) for which we associated the NAD(P)H derivative value Pc with the position in cell cycle φc when perturbation happened. Besides, for each cell \(c \in S2\), we stored the information about the kind of the cell-cycle event closest to perturbation, Ec./p> \overline {F_i} \left( {15 \times 15} \right) + p30\), where Fi is the pixel’s intensity, \(\overline {F_i} \left( {15 \times 15} \right)\) – the mean intensity among the nearest 15 × 15 pixels (roughly, a third of the mother cell) and p30 – the thirtieth percentile among the mother cell’s pixels (Python’s method skimage.filters.threshold_local with block_size = 15, method = ‘mean’, offset = p30 and mode = ‘nearest’). Using the offset p30 helps to discard a small number of cytoplasmic pixels that due to noise happen to be brighter than their neighbors. For the same purpose, after the local thresholding, we removed objects (ensembles of selected pixels) smaller than 25 pixels and having the connectivity equal to 1 (two pixels are connected by one orthogonal step). Eventually, we segmented one object containing the brightest pixels, which represents nucleus. If some pixels inside this object were not selected in the local thresholding (due to noise, some single pixels may be dimmer), then we added these pixels to the selection. To calculate the abundance of the fusion Hta2-mRFP in the mother-cell nucleus, we summed the intensities of the pixels located within the segmented nucleus. Microscopy image processing was performed in Python with the help of the module skimage./p> 0\), where Sij is the coefficient of j = ATP in the reaction i that has the flux \(v_i^{\mathrm{cell}}\left( t \right)\) (mol cell−1 h−1) (due to the steady-state assumption of FBA, the turnover values would be the same if ATP-depletion fluxes only were summed). We showed individual reactions i whose cytoplasmic flux of j = ATP calculated as \(S_{ij}\,v_i^{\mathrm{cell}}\left( t \right)\) is bigger than 0.09 or smaller than −0.09 (mol cell−1 h−1) in at least one cell-cycle phase. In Fig. 4d, for each precursor, we calculated the sum of its fluxes, \(\mathop {\sum}\nolimits_i {S_{ij}v_i^{\mathrm{cell}}(t)}\), in the reactions diverting from central metabolic pathways to the synthesis of major biomass components: for ribose 5-phosphate (r5p), its fluxes in the syntheses of AMP, GMP and UMP as well as phosphoribosyl pyrophosphate; for erythrose 4-phosphate (e4p), its flux in the synthesis of 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate; for phosphoenolpyruvate (pep), its fluxes in the reactions of 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthetase and 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase; for pyruvate (pyr), the l-alanine flux in the reaction of protein biosynthesis; for acetyl-CoA (accoa), its fluxes in the reactions of zymosterol synthesis, homoserine O-trans-acetylase, 2-isopropylmalate synthase and lipid biosynthesis; for glycerol 3-phosphate (g3p), its flux in lipid biosynthesis; for glucose 6-phosphate (g6p), its fluxes in polysaccharide and lipid biosynthesis; for fructose 6-phosphate (f6p), its flux in polysaccharide biosynthesis./p> 
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